Регуляция действия гена на уровне транскрипции
Введение
Участок ДНК, способный кодировать клеточные белки, называют геном. Ген должен быть доступен РНК-полимеразе – ферменту, осуществляющему на ДНК, как на матрице, полимеризацию рибонуклеозидтрифосфатов (РНТФ) с образованием информационной РНК.
Такой процесс получил название транскрипции. На информационной (матричной) РНК, согласно правилам генетического кода, в результате трансляции на рибосомах образуются белки.
Регуляция транскрипции генов в клетках бактерий
Рассмотрим сначала процесс синтеза информационной РНК в клетках бактерий. Он осуществляется с помощью РНК-полимеразы, состоящей из нескольких отдельных взаимодействующих друг с другом белковых субъединиц: α, β, β’, σ. Последняя из них осуществляет основную реакцию полимеризации рибонуклеотидов, остальные помогают ей. РНК-полимераза присоединяется к определенному участку в начале гена - промотеру. В этом районе начинается синтез РНК. Промоторы генов бактерий имеют определенную нуклеотидную последовательность, “узнаваемую” РНК-полимеразой. Узнавание белками определенных участков ДНК основано на специфичном нековалентном взаимодействии аминокислотных остатков с нуклеотидами.
Субъединица сигма узнает промотер, взаимодействуя в основном с большой бороздкой двунитевой спирали ДНК. Сначала образуется “открытый” комплекс ДНК с РНК-полимеразой, когда двунитевая структура ДНК раскрывается, а затем на одной из нитей ДНК, как на матрице, образуется РНК, последовательность нуклеотидов в которой комплементарна матричной нити ДНК. Синтез РНК заканчивается в определенной точке в конце гена. Участок остановки транскрипции часто представлен такой нуклеотидной последовательностью, где связь рибонуклеотидов с комплементарной матричной нитью ДНК ослаблена. Остановку синтеза РНК в определенной точке могут также осуществлять специальные белки.
Существуют белки, которые препятствуют синтезу РНК или, наоборот, необходимы для активной транскрипции вместе с РНК-полимеразой.
Белки, выключающие гены, называют репрессорами, включающие ген, – активаторами. Механизм действия репрессоров обусловлен их специфичным взаимодействием с участком ДНК, называемым оператором. . Молекулы репрессора, связанные с ДНК, либо мешают “посадке” РНК-полимеразы, либо, взаимодействуя с полимеразой и ДНК, препятствуют началу синтеза РНК.
Регуляция транскрипции в клетках эукариот
В клетках эукариот, по сравнению с бактериями, регуляция транскрипции усложнена. Велико число дополнительных белков, обеспечивающих работу РНК-полимераз. РНК-полимеразы состоят из большого числа белковых субъединиц. РНК-полимеразы эукариот сами по себе не способны узнать промотор, в этом им помогают факторы транскрипции. Наиболее важные из них — TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, и TFIIH. Самое начало транскрипции в значительной степени зависит от химической модификации отдельных субъединиц полимеразы.
Перед участком взаимодействия полимеразы с ДНК (собственно промотор) располагаются короткие нуклеотидные последовательности – “мотивы”, узнаваемые факторами транскрипции. Преимущество такого узнавания состоит в том, что небольшая молекула индуктора или активатора, присоединяясь к одной субъединице, резко ускоряет присоединение второй молекулы к другой субъединице, способствуя тем самым быстрому образованию биологически активного белкового комплекса в ответ на изменение концентрации индуктора/активатора в клетке.
Интересно, что энхансер может превращаться в сайленсер в зависимости от того, какие белки с ним будут взаимодействовать в данной клетке. Клетки разных тканей различаются по набору таких регуляторных белков. Благодаря этому достигается процесс дифференцировки в развитии организма, который приводит к образованию разных типов тканей, различающихся наборами работающих генов. Наличие тех или иных белковых факторов, взаимодействующих с промотором или энхансером, либо сайленсером, будет проявляться в том, что данный ген либо будет активно работать (“экспрессироваться”), либо его активность будет подавлена (“репрессирована”).
Выводы
Регуляция транскрипции достигается также благодаря высокоспецифичным взаимодействиям белковых молекул друг с другом. Тем самым обеспечивается образование активирующего комплекса белков вблизи старта транскрипции или, наоборот, создание структуры, препятствующей транскрипции.В клетках высших организмов присутствует большое количество белковых факторов, участвующих в регуляции транскрипции. Промоторы генов, с которыми эти белки взаимодействуют, сложно устроены.
Пространственные структуры белковых факторов должны быть хорошо “подогнаны” друг к другу, обеспечивая тем самым либо работу гена, либо, наоборот, его выключение.
Регуляция действия гена на уровне трансляции и созревания белков
Введение
Существуют три основных способа, как регулировать трансляцию. Первый способ – позитивная регуляция на основе сродства мРНК к инициирующей рибосоме и факторам инициации (дискриминация мРНК). Второй способ – негативная регуляция с помощью белков-репрессоров, которые, связываясь с мРНК, блокируют инициацию (трансляционная репрессия). Этими двумя способами регулируются индивидуальные мРНК, то есть трансляция каждой мРНК может специфически контролироваться независимо от других мРНК клетки. Третий способ – тотальная регуляция трансляции всей совокупности мРНК клетки посредством модификации факторов инициации.
Дискриминация мРНК
Скорость или частота инициации трансляции рибосомами может сильно различаться для разных мРНК. У прокариотических организмов это определяется тем, что инициирующие или рибосомосвязывающие участки разных мРНК имеют разное сродство к рибосомам и, таким образом, с разной эффективностью связывают рибосомные частицы. На основании разницы в эффективности инициации можно говорить о «сильных» и «слабых» мРНК. На сильных мРНК инициация происходит часто, на них нанизывается много рибосом (образуются плотные полирибосомы) и соответственно продуцируется много молекул белка (Рис.1). Редкая инициация трансляции на слабых мРНК дает в результате редкую посадку рибосом на эти мРНК и, следовательно, низкую белковую продукцию.
Похожая ситуация наблюдается и в эукариотических клетках, но там дискриминация мРНК обусловлена скорее разным сродством факторов инициации, а не самих рибосом к разным 5'-проксимальным инициаторным структурам мРНК. Так как факторы инициации в любом случае локализуются на инициирующих малых рибосомных субъеденицах, то они и определяют разную эффективность посадки рибосом на разные мРНК и, таким образом, дискриминируют их на сильные и слабые.
Различная сила мРНК в значительной мере определяет соотношение продукции различных белков в клетке. Так, структурные белки мембран, рибосомные белки, факторы элонгации, белки оболочки вирусов и другие белки, требуемые в большом количестве, кодируются сильными мРНК, а многие специализированные ферменты и регуляторные белки – слабыми мРНК. Как правило, если белок имеет четвертичную структуру, построенную из разных субъединиц в различном соотношении, то сила мРНК или ее отдельных участков (цистронов), кодирующих эти субъединицы, координирована с пропорцией субъединиц в структуре. Например, мембранный комплекс протонной АТФазы бактерий построен из трех типов субъединиц: a, b и c – в соотношении 1 : 2 : 10 (a1b2c10), и соответственно субъединица c кодируется очень сильным цистроном мРНК, субъединица a – слабым, а субъединица b – цистроном промежуточной силы. Таким образом, дискриминацию мРНК можно рассматривать как механизм конститутивного контроля надлежащего фиксированного соотношения продуктов белкового синтеза.
Трансляционное сопряжение у прокариот
Следует отметить, что у прокариот одна длинная полинуклеотидная цепь мРНК может содержать несколько кодирующих последовательностей (цистронов) для различных белков и такие мРНК называются полицистронными. Пользуясь механизмом внутренней инициации, во многих случаях рибосомы могут инициировать трансляцию последовательных цистронов независимо друг от друга (рис. 2, а), и интенсивность инициации и, следовательно, продуктивность цистронов будут определяться их собственной силой. В других случаях, однако, инициация трансляции внутренних цистронов зависит от трансляции предшествующего (5'-проксимального) цистрона: часто инициация трансляции внутреннего цистрона оказывается невозможной без трансляции предшествующего (рис. 2, б и в). Это и есть трансляционное сопряжение.
Различают два типа трансляционного сопряжения. Первый тип – когда рибосомы, транслирующие предшествующий цистрон, расплетают вторичную и/или третичную структуру мРНК, в которой участвует инициаторный участок последующего цистрона. В результате этот инициирующий участок освобождается и становится доступным для инициации свободными рибосомами (рис. 2, б). Другой тип трансляционного сопряжения – реинициация: сам по себе внутренний цистрон вообще недоступен для свободных инициирующих рибосомных частиц и его инициация может быть осуществлена только частицами, терминировавшими на предыдущем цистроне и еще не успевшими соскочить с мРНК (рис. 2, в).
Трансляционная репрессия
Типичный механизм трансляционной репрессии состоит в том, что специальный белок, называемый репрессором, специфически связывается с участком мРНК, перекрывающимся, как правило, с участком связывания рибосомной частицы при инициации трансляции. Таким образом, связываемый белок-репрессор мешает связываться инициирующей рибосомной частице и тем самым либо уменьшает скорость инициации, либо полностью блокирует ее. Часто в месте связывания белка-репрессора имеется не очень стабильная двуспиральная структура – шпилька, которая легко расплетается инициирующей рибосомой. Белок-репрессор стабилизирует шпильку, превращая ее в плохо преодолимый барьер для инициирующей рибосомы (рис. 3).
Во многих случаях репрессором является сам белок, кодируемый данной мРНК. Другими словами, мРНК репрессируется своим же продуктом. В результате получается регуляция по типу обратной связи: производство избыточного количества белка на данной мРНК приводит к связыванию этого белка с инициаторным участком своей мРНК и таким образом к репрессии собственного синтеза. Пример регуляции трансляции по типу обратной связи – репрессия синтеза фермента треонил-тРНК-синтетазы бактерии избыточным количеством этого фермента, связывающегося с инициаторным участком своей мРНК.
В других случаях репрессором является специальный белок, и его способность связываться с определенными мРНК зависит от присутствия того или иного низкомолекулярного компонента – эффектора
Тотальная регуляция трансляции у эукариот
Наиболее обычный путь тотальной регуляции белкового синтеза у эукариот, во всяком случае у животных и грибов – это активация специальной фосфокиназы, которая фосфорилирует фактор инициации eIF2, что приводит к подавлению инициации трансляции всех мРНК клетки. Сигналами для активации фосфокиназы в клетке являются тепловой шок и другие виды стрессовых воздействий, недостаток ростовых факторов, аминокислотное голодание, недостаток железа, вирусные инфекции. Сильное подавление синтеза белка в этих условиях есть следствие именно активации фосфокиназы и катализируемого ею фосфорилирования eIF2. Степень подавления белкового синтеза может варьировать в зависимости от уровня стресса.
Что же происходит в результате фосфорилирования eIF2? Для связывания инициаторной аминоацил-тРНК (Met-tRNAi) с малой рибосомной субъединицей в процессе инициации трансляции требуется eIF2 в комплексе с ГТФ (GTP); в ходе инициации ГТФ гидролизуется на ГДФ (GDP) и ортофосфат и eIF2 в комплексе с ГДФ (eIF2 : GDP) освобождается из рибосомы. На рис. 4 показано, что в норме дополнительный фактор eIF2В принимает участие в том, чтобы превратить отработанный (неактивный) eIF2 : GDP в необходимый для следующей инициации eIF2 : GTP. Этот фактор играет каталитическую роль в обмене ГДФ на ГТФ, и его в клетке мало. Когда eIF2 фосфорилируется фосфокиназой (eIF2Р), он может обычным образом участвовать в инициации трансляции, но, освободившись из рибосомы с ГДФ (в форме eIF2Р : GDP), он образует прочный комплекс с eIF2В (eIF2В : eIF2Р : GDP) и тем самым связывает весь eIF2В клетки, лишая последнюю возможности катализировать регенерацию eIF2 : GTP из eIF2 : GDP.
Toll-like рецепторы
Введение
Согласно сложившемуся представлению, Toll like рецепторы (TLR) — эволюционно консервативные белковые структуры, рассматриваемые как ключевой компонент врожденного и приобретенного иммунитета у млекопитающих.
Открытие Toll-like рецепторов
TLRs впервые выявлены у дрозофилы. Это стало открытием, за которое в 2011 г. авторы Ботлер (США), Хофман (Люксембург) и Стейман (Канада) были удостоены Нобелевской премии. Основная биологическая роль TLRs у дрозофил связана с защитой против инфекций и участием в процессах регенерации. В последующем TLRs выявлены Меджитовым, на клетках млекопитающих было показано, что они имеют общий цитоплазматический домен с интерлейкин 1 рецептором. К настоящему времени TLRs обнаружены у млекопитающих, включая человека, и даже у растений.
Строение Toll-like рецепторов
Все TLRs имеют сходное строение и представляют собой интегральные трансмембранные белки. Поверхностная зона молекулы, ответственная за связывание лиганда, представлена N-концевой областью аминокислотной последовательности из 19—25 повторяющихся участков, обогащенных лейцином. Далее следует переходный участок, отвечающий за прикрепление рецептора к клеточной мембране, обогащенный цистеином. Внутренняя дистальная часть рецептора представлена TIR (Toll/IL- receptor) доменом, получившим свое название из-за одинакового строения этого участка у TLRs и у рецепторов цитокинов семейства IL-1.
Доказательство значимости Toll-like рецепторов
Важное значение участия TLRs в деятельности иммунной системы было доказано в экспериментальных работах на нокаут-мышах, имеющих искусственно вызванные мутации генов различных TLRs. Так, мыши, имеющие мутацию гена, кодирующего TLR4, погибали при инфицировании 1—2 колониеобразующими единицами (КОЕ) Salmonela typhimurium, в то время как у нормальных животных гибель происходила при введении более 2000 КОЕ этих бактерий. В других экспериментах была показана высокая восприимчивость TLR4-дефицитных мышей к Escherichia coli, Neisseria meningitides и Candida albicans. Подобные результаты были получены и при изучении роли TLRs в защите от вирусных инфекций. Опубликованы результаты исследований, в которых показано участие TLRs при развитии опухолей.
Виды Toll-like рецепторов
В зависимости от локализации TLRs в клетке выделяют рецепторы, расположенные на цитоплазматической мембране TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 и TLR10 и на мембранах внутриклеточных органелл TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9 — лизосом, эндосом, аппарата Гольджи. Лигандами рецепторов, локализованных на цитоплазматической мембране, являются поверхностные структуры микроорганизмов — липопротеин, липополисахариды, флагеллин, зимозан.
Участие Toll-like рецепторов во врожденном иммунитете
Участие TOLL LIKE Рецепторов во врожденном иммунитете обеспечивается:
- Инициацией выделения провоспалительных цитокинов, необходимых для физиологического иммунологического ответа при различных воздействиях, среди которых одно из центральных мест занимают различные инфекции;
- регуляцией активности нейтрофилов; особую роль при этом играют TLR-2 и TLR-4, первый из которых защищает клетки от апоптоза, а второй проявляет себя как важный регулятор выживаемости нейтрофилов;
- контролем активации, дифференциации и выживаемости В-лимфоцитов, в котором активное участие принимают TLR-2, TLR-4 и TLR-9 (этот путь активации В-лимфоцитов сопровождается усилением выброса кальция, фосфорилированием некоторых киназ, усилением эндоцитоза, синтеза иммуноглобулинов и рассматривается как альтернативный путь активации В-лимфоцитов);
- обеспечением поддержания врожденного иммунитета кишечника, что связано с экспрессией TLRs эпителиальными клеками его слизистой;
- участием в функционировании клеток центральной нервной ситемы, большинство которых экспрессируют TLRs (микроглия, нейроны, астроциты, эндотелиальные клетки сосудов мозга), имеются данные о дифференцированном влиянии TLRs на функции микроглии.
Участие Toll-like рецепторов в приобретенном иммунитете
Участие TOLL LIKE Рецепторов в приобретенном иммунитете обусловлено:
- Активацией CD4- и CD8-T-лимфоцитов;
- стимуляцией функций различных антиген-распознающих клеток: дендритных, которые экспрессируют TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-7, TLR-9;
- активацией макрофагов, тучных клеток, в частности, с участием TLR-9, что особенно выражено при действии генетического материала ДНК-вирусов бактерий, грибов;
- активным включением в экспансию и функционирование регуляторных клеток — T-reg, которые экспрессируют высокий уровень TLR-4, TLR-5, TLR-7 и TLR-8;
- регуляции гомеостаза фибробластов, миофибробластов, фибробластоподобных синовиоцитов, эндотелиальных и эпителиальных клеток, в частности, с участием TLR-2, TLR-4, TLR-6;
- регуляцией клеток нормального эпителия (TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5), а также клеток эндотелия;
- потенцированием приобретенного иммунитета с включением различных механизмов
Механизмы Toll-like рецепторов
В состоянии покоя неактивированные TLRs находятся на мембране клеток в мономерном состоянии. После распознавания молекулярных «образов» патогенов TLRs активируют каскад реакций передачи сигнала в ядро клетки: при связывании с лигандом рецептор подвергается димеризации, сопровождающейся изменением конформации TIR-домена, который связывается с адапторной молекулой MyD88 (myeloid differentiation protein 88), необходимой для привлечения киназ семейства IRAK (IL-1 receptor associated kinase). После активации IRAK взаимодействует с внутриклеточным фактором TRAF6 (TNF receptor associated factor 6), в результате чего происходит высвобождение ядерного фактора каппа-В (NF-κB) и транслокация его в ядро клетки. Связываясь с промоторными участками генов, ядерный фактор активирует синтез провоспалительных цитокинов, молекул адгезии, костимулирующих молекул с последующей активацией структур адаптивного иммунитета.
Известен также механизм MyD88-независимой передачи активационных сигналов от TLRs. Его принципиальным отличием является то, что TIR-домен взаимодействует с адапторной молекулой TRIF (TIRdomain containing adaptor inducing IFNβ) с последующей активацией внутриклеточного фактора IRF3 (interferon regulatory factor 3), индуцирующего экспрессию генов интерферонов α и β (IFNα и IFNβ), являющихся важнейшими молекулами для дифференцировки Т-лимфоцитов.
Выводы
Таким образом, Toll Like рецепторы являются первыми сигнальными молекулами, распознающими лиганды микроорганизмов и координирующими иммунный ответ.
TLRs являются активными регуляторами не только врожденного и приобретенного иммунитета, но и гомеостаза различных клеток.
